L'exercice maternel grâce à l'apéritine exerkine améliore l'adipogenèse brune et prévient le dysfonctionnement métabolique chez les souris progénitures

L’exercice maternel grâce à l’apéritine exerkine améliore l’adipogenèse brune et prévient le dysfonctionnement métabolique chez les souris progénitures

Perde de graisse

abstrait

Le taux d’obésité augmente rapidement, en raison du manque d’exercice et d’un apport énergétique excessif. Ici, nous avons trouvé une explication non identifiée précédemment, en raison du manque d’exercice maternel. Dans cette étude, des souris maternelles saines ont été affectées à un mode de vie sédentaire ou à un exercice quotidien et le développement de la graisse brune fœtale (MTD) et la santé métabolique de la progéniture ont été analysés. Comparé au groupe sédentaire, l’exercice maternel a amélioré la déméthylation de l’ADN des PRDM16 le développement de promoteurs et de MTD et la prévention de l’obésité des descendants s’ils sont confrontés à un régime énergétique élevé. Apelin, une exerkine, était élevée dans la circulation maternelle et fœtale en raison de l’exercice, et l’administration maternelle d’apelin a imité les effets bénéfiques de l’exercice sur le développement des MTD fœtales et sur la santé métabolique de la progéniture. Ensemble, l’exercice maternel améliore la thermogenèse et la santé métabolique de la progéniture, suggérant que le mode de vie sédentaire pendant la grossesse contribue à l’épidémie d’obésité dans les sociétés modernes.

INTRODUCTION

Aux États-Unis et dans le monde, il y a une épidémie de personnes en surpoids et obèses1) en raison d’un excédent d’approvisionnement énergétique par rapport aux dépenses. Le tissu adipeux brun (MTD) est un organe principal qui brûle les acides gras et le glucose pour une thermogenèse sans frissons, qui consomme beaucoup d’énergie (2, 3). Des adipocytes bruns ont été identifiés dans le tissu adipeux blanc (WAT), appelé tissu adipeux beige ou brite. Semblables aux MTD, ces adipocytes brûlent de l’énergie pour la thermogenèse; les adipocytes beiges existent largement chez l’homme (4, 5). L’amélioration de la fonction thermogénique des MTD et des adipocytes beiges dissipe une énergie excessive, tenant ainsi la promesse de prévenir l’obésité et les maladies métaboliques associées (6, 7). L’initiation de l’adipogenèse brune et le maintien du phénotype des adipocytes bruns nécessitent l’activité du facteur de transcription clé, domaine PR contenant 16 protéines (PRDM16) (8). Son promoteur est enrichi de sites CpG, qui caractérisent un gène clé de développement (9) et une déméthylation active de l’ADN est nécessaire pour déclencher son expression et l’adipogenèse brune (10). Par conséquent, facilitant la déméthylation de l’ADN et l’expression de PRDM16 le gène est une stratégie clé pour atténuer la dysfonction métabolique induite par l’obésité.

L’obésité maternelle et une mauvaise nutrition maternelle, en particulier le régime riche en graisses (HFD) et / ou le régime riche en calories, sont nocifs à la fois pour la santé maternelle et le développement du fœtus, prédisposant la progéniture de l’obésité et du diabète à type 2 (11). Dans notre étude précédente, nous avons constaté que l’obésité maternelle altère le développement des MTD fœtales avec des effets persistants sur sa fonction thermogénique dans la vieillesse, prédisposant à la descendance de l’obésité et du dysfonctionnement métabolique (10). Cependant, l’augmentation de l’obésité infantile ne peut pas être expliquée uniquement par l’obésité pendant la grossesse, car les taux d’obésité chez les enfants augmentent chez les mères ayant différents indices de masse corporelle (12). Par conséquent, il existe des mécanismes supplémentaires, qui sont responsables de l’augmentation des taux d’obésité chez les enfants au cours des dernières décennies. Chez les mères obèses, il a été démontré que l’exercice protège contre l’obésité et les dysfonctionnements métaboliques chez la progéniture (13). Étant donné que l’exercice chez les femmes enceintes devient moins courant quels que soient les indices de masse corporelle maternelle, nous avons émis l’hypothèse que seul le manque d’exercice pendant la grossesse chez les mères maigres peut prédisposer la progéniture à l’obésité et au dysfonctionnement métabolique. De plus, l’exercice stimule la sécrétion d’hormones induite par l’exercice, les employés de bureau, y compris l’apéline, qui sont de plus en plus impliqués dans la régulation du développement placentaire et fœtal (14). Nous avons également émis l’hypothèse que l’élévation de l’apeline due à l’exercice maternel médie ses effets bénéfiques sur le développement des MTD fœtales et la santé métabolique de la progéniture.

En comparant des souris maternelles maigres avec et sans exercice pendant la grossesse, nous avons constaté que l’exercice maternel stimule le développement des tissus adipeux bruns et beiges pendant le développement fœtal et améliore leur fonction thermogénique chez la progéniture, suggérant que le mode de vie sédentaire pendant la grossesse contribue à l’épidémie d’obésité dans la société moderne. L’administration maternelle d’apelin reflète les effets bénéfiques de l’entraînement physique sur la santé métabolique de la progéniture, suggérant une approche thérapeutique auparavant non identifiée pour prévenir l’effet de la programmation de la vie sédentaire maternelle sur l’obésité de la progéniture.

RÉSULTATS

L’exercice pendant la grossesse active les tissus adipeux bruns et beiges

Pour tester les effets de l’exercice pendant la grossesse sur le développement du fœtus, des femmes enceintes ont fait de l’exercice quotidiennement. L’exercice maternel a réduit le gain de poids corporel pendant la grossesse et la différence de poids corporel s’est maintenue pendant l’allaitement (fig. S1, A et B), malgré aucune différence dans l’apport alimentaire (fig. S1 , C et D). Le poids relatif BAT interscapulaire (iBAT), défini comme le rapport de poids humide iBAT entre le poids corporel, était 37,8% plus élevé chez la mère exercée, tandis que le WAT inguinal (ingWAT) était 37,1% plus bas que chez les souris témoins maternelles (CON) (fig S1F). L’exercice a réduit les niveaux de glucose circulatoire maternel et la résistance à l’insuline (fig. S1, G et I), ce qui suggère que l’exercice a des effets préventifs sur le prédiabète sucré gestationnel (13). En revanche, aucun changement significatif n’a été observé dans l’insuline sanguine et la fonction des cellules bêta pancréatiques (Fig. S1, H et K). Nous avons observé que la progéniture des mères exercées présentait un plus grand découplage de l’expression de la protéine 1 (UCP1) à la fois dans iBAT et ingWAT au 18e jour d’embryon (E18.5) et au sevrage (fig. S1, J et L).

L’exercice maternel quotidien induit l’activité d’iBAT et le brunissement de la progéniture ingWAT

Au sevrage, le poids corporel et la masse ingWAT de la progéniture femelle (M-Ex) née de mères qui faisaient de l’exercice étaient plus faibles, mais la masse iBAT était plus élevée que la progéniture des souris CON sédentaires (M-Ctrl). De manière cohérente, le poids de l’iBAT a également augmenté chez la progéniture mâle M-Ex, tandis que l’ingWAT et le poids corporel étaient similaires (Fig. 1, A et B). En outre, dans iBAT et ingWAT de progéniture M-Ex femelle et mâle, l’expression de l’ARNm des marqueurs bruns des adipocytes, y compris UCP1, PPARGC1Aet PRDM16 (Fig. 1C) était supérieure à celle des souris M-Ctrl. De façon constante, les descendants femelles et mâles nés de mères exercées avaient des niveaux plus élevés de protéine UCP1, de PRDM16 et de récepteur activateur-activé α1 (PGC-1α) dans iBAT et ingWAT que dans la progéniture M Ctrl au sevrage (Fig. 1, E et F et fig. S2, A et B). Il n’y avait pas de différence dans la taille des déchets entre les groupes (fig. S2C).

Fig.1 L’intervention de l’exercice maternel induit nettement l’expression de marqueurs thermogéniques dans iBAT et ingWAT de la progéniture au sevrage.

(A et B) Poids corporel (A) et poids humide relatif d’iBAT et ingWAT (B) normalisés au poids corporel de la progéniture M-Ctrl et M-Ex femelle et mâle au sevrage (n = 6 souris par groupe). N.S., non significatif. (C) Z des dizaines de niveaux d’ARNm de différents marqueurs de graisse brune dans l’iBAT et ingWAT de la progéniture M-Ctrl et M-Ex au sevrage (n = 6 souris par groupe). L’expression a été normalisée par ΔCt valeurs. () Taches occidentales de coupure de UCP1, PRDM16 et PGC-1α dans iBAT (la β-tubuline contrôle la charge) des fœtus E18.5 de souris maternelles CON et EX (n = 6 fœtus par groupe). (et et fa) Points de coupure occidentaux d’UCP1 et de PRDM16 (la β-tubuline contrôle la charge) d’iBAT (E) et d’ingWAT (F) isolés de souris M-Ctrl et M-Ex mâles et femelles au sevrage (n = 6 souris par groupe). Les données sont moyennes ± SEM et chaque point représente une portée. *P <0,05, **P <0,01 et ***P <0,001 d'élève non couplé à deux queues t test (A à C, E et F) ou analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) (D).

Pourquoi le développement de BAT commence avant E15.5 (15), nous avons en outre analysé les effets de l’exercice maternel sur le développement des MTD fœtales. Dans l’iBAT fœtal d’embryons E18.5, les niveaux de protéines UCP1, PRDM16 et PGC-1α étaient plus élevés dans M-Ex que dans M-Ctrl pour les fœtus féminins et masculins (Fig. 1D). Ces différences ont été maintenues dans iBAT et ingWAT au sevrage (Fig. 1, E et F). En accord, de petites tailles de gouttelettes lipidiques ont été observées dans la ingWAT de la descendance de sevrage M-Ex femelle et mâle, montrant une accumulation lipidique plus faible (fig. S2, de D à H). Ensemble, ces données démontrent que l’exercice maternel améliore l’adipogenèse brune et beige chez les fœtus et les souris progénitures.

L’exercice maternel améliore la fonction thermogénique chez la progéniture après l’EC

Parce que l’exposition au froid (EC) stimule la thermogenèse dans les adipocytes BAT et beiges (4), nous avons analysé si l’activité thermogénique de la progéniture M-Ex était améliorée après 2 jours d’EC. Après CE, la différence dans la masse iBAT de la progéniture M-Ex et M-Ctrl est devenue encore plus élevée (figures 1B et 2A), ce qui était moins évident chez les souris de la lignée M-Ctrl et M-Ex sans CE (Fig. fig. S3B). De plus, M-Ex a provoqué une température intrascapulaire plus élevée chez les descendants femelles et mâles que les descendants M-Ctrl après 2 jours d’EC (Fig.2B), démontrant une thermogenèse plus élevée chez les descendants M-Ex. Après 2 jours d’EC, les niveaux de protéines des marqueurs thermogéniques, y compris UCP1 et PRDM16 dans iBAT et ingWAT, étaient également plus élevés chez la progéniture M-Ex (Fig. 2, C et D). L’analyse immunocytochimique a montré une coloration UCP1 plus forte dans iBAT et ingWAT de souris M-Ex avec et sans CE (figure 2E). Pour déterminer si une thermogenèse améliorée pourrait améliorer la santé métabolique, nous avons examiné les niveaux de glucose et d’insuline dans le sang et la présence de résistance à l’insuline. Aucune différence n’a été observée entre les descendants M-Ctrl et M-Ex sans CE. Cependant, dans le groupe M-Ex, CE a réduit les niveaux basaux de glucose et amélioré la sensibilité à l’insuline (fig. S3, C à F). Pour évaluer si des changements dans le métabolisme du glucose altéré pourraient être dus à une absorption plus élevée de glucose dans l’iBAT, nous avons analysé l’expression du transporteur de glucose membre 4 (GLUT4) dans l’iBAT à température ambiante (RT) et EC et nous avons montré que le niveau de la protéine GLUT4 était plus élevé dans la descendance M-Ex femelle et mâle après EC (Fig. 2F). Ensemble, nos données démontrent que M-Ex induit la fonction thermogénique des MTD et du tissu adipeux beige chez les deux sexes de la progéniture.

Fig.2 L’intervention de l’exercice maternel facilite la thermogenèse dans l’iBAT et dans l’ingWAT de la progéniture après l’EC.

(A) Poids humide iBAT de la progéniture M-Ctrl et M-Ex femelle et mâle de 2 jours de CE (n = 5 souris par groupe). (B) Images thermographiques représentatives (à gauche) et moyennes calculées de la température intrascapulaire (à droite) de la progéniture femelle et mâle M-Ctrl et M-Ex à température ambiante (RT) et 2 jours d’EC (n = 6 portées pour RT et n = 5 portées par CE). (C et ) Points de coupure occidentaux d’UCP1 et de PRDM16 (la β-tubuline contrôle la charge) d’iBAT (C) et ingWAT (D) de la progéniture M-Ctrl et M-Ex femelle et mâle suivis de 2 jours d’EC (n = 5 souris par groupe). (et) Images représentatives de la coloration immunocytochimique UCP1 d’iBAT et ingWAT de la progéniture M-Ctrl ou M-Ex à RT ou CE. Barres d’échelle, 100 microns. DAPI, 4 ‘, 6-diamidino-2-phénylindole. (fa) Points de coupure occidentaux de GLUT4 dans iBAT (la β-actine a été utilisée comme contrôle de charge) isolés de la progéniture M-Ctrl ou M-Ex à TA et après 2 jours d’EC (n = 6 portées pour RT et n = 5 portées par CE). Les données sont moyennes ± SEM et chaque point représente une portée. *P <0,05, **P <0,01 et ***P <0,001 dans M-Ctrl contre M-Ex e ###P <0,001 en RT contre CE par les étudiants non associés à deux files d'attente t test (A, C et D) ou ANOVA bidirectionnelle (B et F).

L’exercice maternel protège la progéniture de l’obésité induite par l’alimentation et de la résistance à l’insuline

Pour examiner plus en détail l’effet protecteur du M-Ex sur la santé métabolique de la progéniture, nous avons soumis les souris à 8 semaines d’alimentation HFD. En particulier, la progéniture M-Ex femelle et mâle consommait plus de nourriture que la progéniture M-Ctrl (Fig. 3A). Cependant, la progéniture femelle M-Ex a montré un gain de poids corporel plus faible que la progéniture femelle M-Ctrl, alors qu’il n’y avait pas de différence dans la progéniture mâle M-Ex en poids corporel. Cependant, le poids ingWAT a été réduit pour la progéniture M-Ex femelle et mâle (Fig. 3, B et C). De plus, les deux sexes de la progéniture M-Ex ont démontré une meilleure tolérance au glucose que la progéniture M-Ctrl (Fig. 3, E et F), en ligne avec les taux de glucose à jeun et les niveaux d’insuline inférieurs chez la progéniture M -Ex (Fig.3, de D à H). Nous avons également trouvé une corrélation positive entre le glucose / insuline maternel et leur progéniture, suggérant que les états métaboliques maternels pourraient contribuer à l’amélioration du développement et du métabolisme fœtal de leur progéniture (fig. S4, A à D). En accord, l’accumulation de lipides hépatiques a été observée chez la progéniture M-Ctrl femelle et mâle par rapport à leur progéniture M-Ex correspondante (figure 3I).

Fig. 3 L’exercice maternel protège la progéniture de l’obésité induite par HFD.

(A pour C) Apport alimentaire quotidien (A), gain de poids corporel (B) et poids humide ingWAT (C) de souris M-Ctrl et M-Ex mâles et femelles nourries avec un virus HFD pendant 8 semaines (n = 6 souris par groupe). ( pour H) Test de tolérance au glucose (E et F), d’insuline dans le sang (D), de résistance à l’insuline (G) et de fonction des cellules pancréatiques β (H) des descendants M-Ctrl et M-Ex femelles et mâles auxquels il était administré un HFD pendant 8 semaines avec un jeûne de 5 heures (n = 6). AUC, aire sous la courbe. (Je) Coloration rouge O de l’huile hépatique de la progéniture femelle et mâle M-Ctrl et M-Ex. Barre d’échelle, 100 microns. (J et K) La consommation d’oxygène s’est résolue au fil du temps et l’analyse de la progéniture femelle et mâle M-Ctrl ou M-Ex qui a reçu un HFD pendant 8 semaines. Le graphique montre les moyennes calculées de chaque portée (n = 5 portées). Les données sont moyennes ± SEM et chaque point représente une portée. *P <0,05, **P <0,01 et ***P <0,001 dans M-Ctrl contre M-Ex et ###P <0,001 chez les femmes contre les hommes des étudiants non appariés non appariés t test (de A, C à H, J et K) ou ANOVA bidirectionnelle (B).

En particulier, suite au défi HFD, le VO2 et VCO2 les niveaux étaient plus élevés dans la progéniture M-Ex que dans la progéniture M-Ctrl (Fig. 3, J et K et fig. S5, A et B), tandis que l’utilisation du substrat n’a pas été modifiée, sur la base des rapports d’échange respiratoire inchangé (RER) (fig. S5, C et D). L’exercice maternel a augmenté l’oxydation des glucides chez les descendants femelles et mâles atteints de HFD (fig. S5, E à H). Ces taux accrus de consommation d’oxygène (OCR) et d’oxydation des glucides étaient cohérents avec le poids humide et la température iBAT élevés dans la descendance M-Ex (Fig.4, A et B). En outre, la régulation à la hausse des niveaux de protéines thermogéniques UCP1 et PRDM16 dans iBAT et ingWAT de la progéniture M-Ex femelle et mâle était parallèle aux OCR (Fig. 4, C et F). Chez les descendants femelles et mâles atteints de HFD, des corrélations négatives ont été trouvées entre les niveaux de protéines iCPB / ingWAT UCP1 et la glycémie / résistance à l’insuline (fig. S4, E à P), démontrant que l’exercice la mère a protégé le dysfonctionnement métabolique de la descendance provoquée par l’HFD, compatible avec l’activité thermogénique adipeuse brun / beige régulée à la hausse (4). Au microscope, les gouttelettes lipidiques d’iBAT chez la progéniture M-Ex femelle et mâle étaient plus petites que celles de la progéniture M-Ctrl, tandis que la densité mitochondriale était plus élevée chez la progéniture M-Ex (Fig.4, D et G), qui était liée à la petite taille des gouttelettes lipidiques dans le ingWAT de la progéniture M-Ex par rapport à la progéniture M-Ctrl (Fig.4, de E et de H à J). Ensemble, nos données démontrent que l’exercice maternel pendant la grossesse améliore le développement du tissu adipeux fœtal brun / beige et protège la progéniture de l’obésité et des syndromes métaboliques lors de la consommation de HFD, courant dans les sociétés occidentales.

Fig.4 L’exercice maternel protège la détérioration des marqueurs thermogéniques et la formation de descendants provoqués par la HFD dans iBAT et ingWAT.

(A et B) Poids humide iBAT relatif (A) et images thermographiques représentatives (à gauche) et moyennes calculées de la température intrascapulaire (à droite) (B) de la progéniture M-Ctrl et M-Ex femelle et mâle avec HFD (n = 6). (C et fa) Des spots Western coupés de niveaux de protéines UCP1 et PRDM16 ont été utilisés dans iBAT (C) et ingWAT (β-tubuline ou β-actine comme contrôle de charge) (F) de la progéniture M-Ctrl et M-Ex femelle et homme atteint de HFD (n = 6). ( et sol) Images d’hématoxyline et d’éosine (H&E) (D) au microscope électronique à coloration et à transmission (G) de l’iBAT de progénitures femelles et mâles éprouvées par HFD. Barres d’échelle, 100 μm (D) et 1 μm (G); m .: mitochondries; l .: gouttelettes lipidiques. (et et H pour J) Coloration H&E (E), surfaces transversales moyennes (CSA) (H) et répartition en pourcentage des gouttelettes lipidiques (I et J) dans le ingWAT de la progéniture femelle et mâle en difficulté HFD. Barre d’échelle, 100 microns. Les données sont moyennes ± SEM et chaque point représente une portée. *P <0,05, **P <0,01 et ***P <0,001 en M-Ctrl contre le M-Ex bilatéral de Student t test (de A à C, F et H).

L’intégration d’Apelin pendant la grossesse favorise le développement des MTD fœtales

Les niveaux de protéines d’apéline ont été nettement régulés à la hausse chez les mères et leurs fœtus exercés à E18,5. Cette différence a été maintenue chez la progéniture après la provocation HFD (figure 5A). De façon cohérente, les niveaux d’apéline circulatoire chez les mères qui faisaient de l’exercice et leurs fœtus avaient augmenté (Fig. 5, B et D). L’augmentation de l’apéline dans la circulation fœtale provient probablement du placenta fœtal. Exercice pendant la grossesse expression profonde de l’apelin dans la zone labyrinthique du placenta, le côté fœtal du placenta (fig. S6A). L’exercice crée un environnement hypoxique dans le placenta (16), qui stimule la vasculogenèse. Ces cellules endothéliales vasculaires en développement sont les principales sources de sécrétion d’apelin (17). La vascularisation placentaire a augmenté en raison de l’exercice maternel (16). En outre, par rapport à d’autres organes / tissus fœtaux, l’expression de l’apéline était beaucoup plus élevée dans le placenta (fig. S6B), ce qui correspond au placenta comme source d’apéline dans la circulation fœtale stimulée par l’exercice maternel.

Fig. 5 La supplémentation en apéline induit une adipogenèse brune dans les MTD fœtales à E18,5.

(A) Points de coupure occidentaux des niveaux de protéine apéline dans les MTD (la β-tubuline a été utilisée comme contrôle de la charge) des souris fœtales et des descendants (n = 6). apelin (APLN) (BConcentrations sériques d’apéline (APLN) chez la souris maternelle à E18,5 (n = 6). (C) Protocole d’intégration Apelina (i.p.). (Concentrations sériques d’apelin chez les fœtus féminins et masculins de l’exercice maternel (ME) et études APN (n = 6). (et) Poids humide des MTD des fœtus femelles et mâles traités par la mère avec de l’apéline (0,5 μmol / kg par jour) ou une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (n = 6). (fa et sol) Z Scores au niveau de l’ARNm de différents marqueurs de la graisse brune dans les MTD fœtales femelles (D) et mâles (E) (n = 6). L’expression a été normalisée par ΔCt valeurs. (H) Points de coupure occidentaux de phosphorylation de UCP1, PGC-1α, PRDM16 et AMPK (la β-tubuline a été utilisée comme contrôle de la charge) chez les femelles et les hommes foetaux traités par BAT maternels maternels avec l’apelin ou le PBS (n = 6). Les données sont moyennes ± SEM et chaque point représente une portée. *P <0,05, **P <0,01 et ***P <0,001 dans CON contre EX, M-Ctrl contre M-Ex ou PBS contre APN et ##P <0,01 chez les femmes par rapport aux hommes des étudiants bilatéraux t test (de A, B et D à H) ou Z score (F et G). F0, génération de branche initiale; F1, première génération filiale.

Pour explorer les effets médiatiques possibles de l’apelin, nous avons effectué une supplémentation en apelin par injection quotidienne de pyrocutamate d’apelin-13 pendant la grossesse (figure 5C). À E18,5, le traitement par l’apéline a induit une hypoxie placentaire (fig. S6C) et un gain de poids humide iBAT des fœtus femelles et mâles (fig. 5E). De plus, le traitement par l’apéline a également augmenté la teneur en protéines des marqueurs adipocytaires bruns, y compris UCP1, PRDM16 et PGC-1α dans l’iBAT fœtal à E18,5 (figure 5H) et l’expression de l’ARNm de UCP1, PPARGC1A, PRDM16, CIDEA, Elovl3et Cox7a1 (Fig. 5, F et G), ainsi que les niveaux d’apelin circulatoire chez les fœtus femelles et mâles (Fig. 5D). Pour analyser plus en détail les rôles médiatiques de l’apelin dans le développement des MTD fœtales, nous avons effectué le séquençage de l’ARN (RNAseq) en utilisant le séquençage à terme du transcriptome sur site complet (WTTS), qui a montré que l’administration d’apelin pendant la grossesse non seulement elle a amélioré l’adipogenèse brune, la phosphorylation oxydative, l’activité mitochondriale et la fonction moléculaire, mais elle inhibe également le processus lipidique synthétique et la différenciation des adipocytes blancs dans les MTD fœtales (fig. S7). En bref, nos données ont montré que l’exercice induisait un environnement hypoxique placentaire, ce qui augmentait la vascularisation et stimulait l’expression de l’apéline dans le placenta, augmentait la teneur en apéline dans la circulation fœtale et améliorait l’adipogenèse du fœtus brun. Ces données suggèrent un rôle important de l’apelin dans la médiation des effets bénéfiques de l’exercice maternel et du développement des MTD fœtales.

Nous avons en outre analysé la phosphorylation de la protéine kinase A (PKA), une cible directe du récepteur de l’apéline (APJ) et d’un récepteur couplé à la protéine G. La supplémentation en apéline a inhibé la phosphorylation de la PKA dans les MTD fœtales (fig. S8A) , conformément au rapport précédent qui montrait que l’APJ s’accouple avec GJe réduire la synthèse cyclique de l’adénosine monophosphate (AMPc) (18). Nous avons en outre mesuré la phosphorylation de la protéine kinase activée par l’AMP (AMPK) et constaté que l’apelin activait de manière significative l’AMPK (Fig. S8, B à D), suggérant que la thermogenèse induite par l’apelin pourrait être due à l’activation de l’AMPK (19).

L’exercice maternel induit une hypométhylation de l’ADN dans le PRDM16 promoteur via un axe dépendant de l’apéline / α-KG

Auparavant, nous avons constaté qu’une faible concentration d’α-cétoglutarate (α-KG) est un facteur limitant de la déméthylation de l’ADN de PRDM16 promoteur au cours du développement de la MTD, qui régule l’adipogenèse brune (10). Compatible avec hautement activé PRDM16 Expression d’ARNm (Fig. 6A), méthylations d’ADN [5-methylcytosine (5mC)] Les déméthylations de l’ADN ont été réduites [5-hydroxymethylcytosine (5hmC)] ont été élevés dans les MTD fœtales par des mères exerçant (Fig.6, B et C), qui ont été maintenues après le défi HFD dans leur progéniture (Fig.6D), montrant les effets de la programmation de l’exercice maternel sur la santé métabolique de la progéniture . De plus, l’expression de l’isocitrate déshydrogénase (IDH), qui catalyse l’α-KG (10), a été améliorée dans le BAT M-Ex fœtal (Fig. 6, F et G), conformément à la concentration élevée en α-KG dans le BAT M-Ex fœtal (Fig. 6E), qui était corrélée à un concentration de 5hmC, un intermédiaire de déméthylation de l’ADN (fig. S9, de A à C).

Fig.6 L’exercice maternel induit la déméthylation des PRDM16 promoteur à travers l’axe apéline / α-KG.

(A) Expression de l’ARNm de PRDM16 MTD fœtale de M-Ctrl et M-Ex (n = 6). L’expression a été normalisée par ΔCt valeurs. (B) Diagramme montrant trois régions du PRDM16 promoteur. (C, et H) Pli d’enrichissement de 5mC et 5hmC de MTD fœtale (étude ME, C; étude APN, H) et de la progéniture adulte éprouvée avec HFD (D) (n = 6). (et) Rapport α-KG sur 2-hydroxyglutarate (2-HG) de l’iBAT fœtal de l’étude ME ou APN (n = 6). (fa, sol, Jeet J) Z Scores au niveau de l’ARNm des dix-onze familles de translocation (Tet) et IDH dans l’iBAT fœtal de l’étude APN (I et J) ou ME (F et G) (n = 6). L’expression a été normalisée par ΔCt valeurs. (K) Modèle de travail: déméthylation de l’ADN stimulée par α-KG / AMPK / apeline maternelle induite par l’exercice. Les données sont moyennes ± SEM et chaque point représente une portée. *P <0,05, **P <0,01 et ***P <0,001 en M-Ctrl contre M-Ex ou PBS contre APN étudiant bilatéral t test (A à J).

L’administration d’Apelin a réduit 5mC mais a augmenté les concentrations de 5hmC dans les MTD fœtales des souris sédentaires (Fig. 6H), conformément aux données BAT M-Ex. Les concentrations d’α-KG, d’IDH et de translocation de dix à onze ont également été élevées par l’administration d’apéline (Fig. 6, E, I et J). Ensemble, nos données suggèrent que l’exercice maternel améliore la déméthylation de l’ADN des PRDM16 promoteur, qui favorise PRDM16 expression des gènes dans les MTD fœtales. Apeline induite par l’exercice maternel pourrait médier les effets bénéfiques de l’exercice maternel sur le développement des MTD fœtales et ses effets de programmation sur la santé métabolique de la progéniture (Fig. 6K).

Pour explorer si l’exercice maternel est spécifiquement bénéfique pour les gènes clés qui régulent l’adipogenèse brune, nous avons analysé la méthylation de l’ADN des régions promotrices des gènes liés à la thermogenèse ou non liés impliqués dans la différenciation des cellules souches mésenchymateuses, y compris PPARGC1A (maître coactivateur de la biogenèse mitochondriale), protéine de doigt de zinc 423 (Zfp423; début de l’adipogenèse blanche) (20) facteur de transcription lié à runt 2 (runx2; différenciation des ostéoblastes médiateurs) (21) et gène de boîte jumelée 3 (Pax3; différenciation myogénique précoce) (22) (fig. S9D). Méthylation de l’ADN de PPARGC1A les régions promotrices ont été réduites chez les fœtus M-Ex et apelin (APN) femelles et mâles par rapport au M-Ctrl et au sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS), respectivement. En revanche, aucune différence dans la méthylation de l’ADN des Zfp423, runx2et Pax3 des régions promotrices ont été trouvées parmi les groupes (fig. S9E).

DISCUSSION

L’adaptation de la mère à des stimuli environnementaux défavorables a été associée à divers changements physiologiques chez la progéniture (11, 23), établissant que l’obésité maternelle est un facteur important dans le développement de l’obésité et du diabète sucré de type 2 chez la progéniture (23). L’exercice est un outil thérapeutique important pour lutter contre l’obésité induite par l’alimentation chez l’adulte (16, 24), qui peuvent entraîner des changements cliniquement importants dans la morphologie des MTD et l’activité mitochondriale (25). Malgré ces ratios d’exercice positifs pour améliorer l’expression de UCP1 (26), Expression PRDM16 (24) et la biogenèse mitochondriale (25), des cas ont également été signalés dans lesquels l’exercice physique n’affecte pas l’activité thermogénique et mitochondriale des MTD (27) ou même une régulation négative de la thermogenèse des MTD (28). Ces ratios incohérents peuvent être dus à la différence dans les types d’exercice, l’intensité et la durée et les conditions physiologiques des animaux (29), ainsi que le moment de la collecte des échantillons après l’exercice (29). Jusqu’à présent, les effets de l’exercice pendant la grossesse sur le développement fœtal n’ont été examinés que chez les mères obèses (13) et ses effets sur le développement des MTD fœtales et la thermogenèse à long terme des descendants nés de mères en bonne santé sont inconnus. Nos données montrent que l’exercice de mères en bonne santé pendant la grossesse peut améliorer la fonction des MTD et de la graisse beige chez la progéniture, ce qui empêche la progéniture de l’obésité et du dysfonctionnement métabolique induit par l’HFD.

L’exercice et l’EC sont connus pour stimuler les activités du tissu adipeux brun / beige (4, 25) et leur thermogenèse est due à la déconnexion de la respiration de la synthèse d’adénosine triphosphate par UCP1 (30). En accord, nous avons constaté que le développement des MTD fœtales était facilité par l’exercice maternel. De plus, nous avons constaté que l’élévation de la fonction BAT fœtale était maintenue chez la progéniture des souris M-Ex. L’expression basale de la protéine UCP1 dans iBAT et ingWAT de la progéniture M-Ex était élevée par rapport aux souris M-Ctrl. En outre, la CE a considérablement augmenté l’activité du tissu adipeux brun / beige chez les descendants nés de mères ayant fait de l’exercice (31). Après avoir provoqué un HFD, la progéniture née de mères pratiquées a été protégée contre l’obésité induite par l’alimentation. En conséquence, il y a eu une amélioration de la tolérance au glucose et de la sensibilité à l’insuline et une réduction des taux de glucose et d’insuline à jeun chez les descendants femelles et mâles atteints de HFD. Ensemble, ces données démontrent les effets bénéfiques à long terme de l’exercice maternel sur la santé métabolique de la progéniture et soutiennent le rôle préventif de l’exercice maternel dans la tolérance au glucose et dans le métabolisme de la progéniture née de souris maternelles obèses (13).

Apelin, une hormone peptidique induite par l’exercice et l’adipo-myokine (exerkine), joue un rôle clé dans la régulation de l’absorption des nutriments des trophoblastes placentaires et du lien endocrinien entre la mère et le fœtus (14), ce qui améliore l’homéostasie du glucose fœtal (32) et améliore l’adipogenèse brune et le métabolisme musculaire (19, 33). De plus, la sécrétion d’apelin dépendante de l’exercice inverse la perte musculaire liée à l’âge, la sarcopénie et favorise la mitochondriogenèse et la synthèse protéique des fibres musculaires (33). Pendant la grossesse, l’exercice induit une condition hypoxique dans le placenta (16, 34). Parce que l’hypoxie stimule l’expression de l’apéline et que le placenta est le site principal pour la synthèse et la sécrétion de l’apéline (14, 35), l’hypoxie placentaire induite par l’exercice peut expliquer la forte concentration d’apéline fœtale. En tant que peptide, l’apelin maternel ne doit pas traverser la barrière placentaire (36). In accordo, abbiamo scoperto che l’apelina è stata elevata a seguito di esercizio sia nella circolazione materna che fetale e nella BAT, suggerendo che il sistema apelinergico potrebbe essere un bersaglio terapeutico che promuove l’adipogenesi del feto, mantenendo così l’omeostasi metabolica. Coerentemente, negli adulti, il sistema apelinergico facilita l’adipogenesi marrone e la doratura degli adipociti bianchi (19).

Il sorprendente trattamento dell’apelina ha migliorato lo sviluppo della BAT fetale e la salute metabolica della prole, che ha imitato gli effetti benefici dell’esercizio materno. Meccanicamente, la somministrazione di apelin non solo ha stimolato l’attivazione di AMPK e la produzione di α-KG, ma ha anche migliorato la demetilazione del DNA del PRDM16 promotore e PRDM16 è un fattore critico che inizia e mantiene l’adipogenesi marrone e la funzione termogenica8). Come fattore limitante della velocità dell’adipogenesi marrone, l’elevazione di α-KG nella BAT fetale dovuta all’esercizio fisico favorisce l’adipogenesi marrone (10). Sfortunatamente, il moderno stile di vita nei paesi occidentali rende l’esercizio meno comune, comprese le donne durante la gravidanza (37). I nostri dati suggeriscono che il sistema apelinergico potrebbe essere un obiettivo terapeutico per migliorare lo sviluppo della BAT fetale, disaccoppiando lo stile di vita sedentario delle donne in gravidanza con una salute metabolica non ottimale nella loro prole. Da notare che l’esercizio materno e il trattamento con apelina probabilmente hanno ulteriori effetti trofici oltre a migliorare lo sviluppo della BAT fetale, il che merita ulteriori esplorazioni.

Mentre la notevole consistenza degli effetti fisiologici e molecolari si riscontra nei feti tra i sessi in base all’esercizio materno o alla somministrazione di apelina, il dimorfismo sessuale dei topi della prole si è verificato dopo aver avuto problemi con l’HFD. Durante la sfida HFD, il peso corporeo della progenie maschile non differiva tra la progenie M-Ctrl e M-Ex, ma le femmine M-Ex hanno guadagnato meno peso corporeo rispetto alla M-Ctrl. Complessivamente, i topi maschi di prole hanno guadagnato più peso durante l’alimentazione HFD con un più alto peso di grasso inguinale e livelli più alti di insulina rispetto alle femmine. La probabile spiegazione è che i maschi tendevano ad aumentare di peso e sviluppare obesità e disfunzione metabolica sotto la sfida dell’HFD rispetto alle femmine (38, 39), con conseguenti differenze fenotipiche tra la progenie femminile e quella maschile dopo la sfida HFD.

In sintesi, abbiamo scoperto che l’esercizio materno durante la gravidanza aumenta notevolmente la funzionalità dei tessuti adiposi marroni / beige, che comporta un aumento della demetilazione del DNA del PRDM16 promotore e elevata concentrazione di α-KG nella BAT fetale dovuta all’esercizio materno, proteggendo i topi prole dall’obesità e dalle disfunzioni metaboliche indotte dall’HFD. Gli effetti benefici dell’esercizio materno sullo sviluppo delle BAT fetali e prole sono stati riprodotti attraverso la somministrazione materna di apelina. Questi risultati suggeriscono che le attività fisiche durante la gravidanza sono fondamentali per la salute metabolica della prole, lo stile di vita sedentario delle donne durante la gravidanza può contribuire all’epidemia di obesità nelle società moderne e il sistema apelinergico è un potenziale bersaglio per ottimizzare la salute metabolica della prole nata dalle madri con lo stile di vita sedentario comune.

METODI

Topi

Topi C57BL / 6J di tipo selvatico femminile (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) a ​​8 settimane di età sono stati assegnati in modo casuale a due gruppi di CON ed EX (esercizio) e alimentati ad libitum con una dieta convenzionale di roditori (CD; 10% energia dai grassi, D12450J, Research Diets, New Brunswick, NJ). Topi femmine non gravide sono stati alloggiati in una stanza controllata su un ciclo di luce / buio invertito di 12 ore. After 1 week of acclimation to treadmill exercise training, female mice were mated with males fed on a CD. Mating was determined by the presence of vaginal smears. At birth, the litter size was normalized to 6. Pups were weaned at postnatal day 21. Offspring from maternal CON mice were designated as M-Ctrl, and those from exercised mothers were designated as M-Ex. In the apelin supplementation study, 9-week-old C57BL/6J female mice (the Jackson Laboratory) fed a CD were further randomly assigned into two groups injected with either apelin or PBS (PBS, n = 6; APN, n = 6). Apelin was injected daily with [pyr1]apelin-13 (AAPPTec, Louisville, KY) at 0.5 μmol/kg per day [intraperitoneally (i.p.)] for 16 days (E1.5 to E16.5), as previously described (33). Simultaneously, age-matched pregnant C57BL/6J mice were injected with PBS and served as controls. All experimental animals were euthanized 2 days after the last apelin or PBS injection at E18.5.

Weanling offspring mice (one female and male per litter) were subjected to CE (n = 6 for general treatment at weaning and n = 5 for CE). After weaning, the remaining female and male offspring were weaned onto HFD (60% energy from fat; D12492, Research Diets) ad libitum to mimic a postweaning obesogenic environment. Maternal mice, and one female and one male per litter at weaning and after 8-week HFD challenge, were anesthetized for further analyses.

In a separate cohort of animals, at E18.5, after 5-hour fasting, maternal mice were euthanized by carbon dioxide inhalation and cervical dislocation, and female and male fetuses were collected separately (fig. S1E and Fig. 5C). Fetal sex identification was based on polymerase chain reaction (PCR) (40). All animal studies were approved by the Institute of Animal Care and Use Committees at the Washington State University.

Treadmill exercise protocol

In maternal daily exercise training, the training protocol followed the principles of progressive loading in exercise intensity and duration based on the previous report (16). Briefly, 1 week before mating, all female animals underwent adaptation on the treadmill running following the protocol of 10 min at 10 m/min, three times per week for a week. After this adaptation, animals were mated and then started to be trained from E1.5 to E16.5 for collecting fetal samples at E18.5 or from E1.5 to E20.5 for delivering pups. On the basis of the guidelines, maximal OCR (VO2) was measured before gestation, which was applied for setting intensity of treadmill exercise training as follows: E1.5 to E7.5 (40% of VO2max), E8.5 to E14.5 (65% of VO2max), and E15.5 to E20.5 (50% of VO2max). Each exercise stage was conducted based on the three steps: warming up (5 m/min for 10 min), main exercise (10 to 14 m/min for 40 min), and cool down (5 m/min for 10 min), being performed at the same time every morning. Sedentary CON mice were placed on the treadmill (speed set at 0 m/min) for an hour daily as previously described (16).

Cold exposure

For cold stimulation, one female and one male weanling mouse from each litter were kept at either 5° or 22°C for 2 days and fed ad libitum with water provided (4).

Indirect calorimetry

Indirect open-circuit calorimetry measurements were performed by using Comprehensive Lab Animal Monitoring System (Columbus Instruments, Columbus, OH) according to the manufacturer’s protocols and guidelines. Briefly, mice were acclimated to the metabolic cages for an hour before recording. During measurement, mice were fed ad libitum with the designated diets, and water was provided (16).

Thermal imaging

Surface temperatures were measured with an E6 Thermal Imaging Infrared Camera (FLIR System, Wilsonville, OR) and analyzed with FLIR Tools Software (FLIR System) (10).

Transmission electron microscope

Tissues were processed on the basis of previous reports (6, 10).

Glucose tolerance test

Mice were fasted for 15 hours and then injected with d-glucose (2 g/kg body weight, i.p.), and blood was collected and measured from the tip of the tail at 0, 15, 30, 60, 90, and 120 min after glucose injection. Levels of blood glucose were measured with a blood glucose meter (Contour Blood Glucose Meter, Bayer, Mishawaka, IN) (10).

Biochemical analysis of serum

Following 5-hour fasting, blood for biochemical analysis was collected from heart via cardiopuncture under anesthesia and used for measuring insulin and glucose levels. Fetal blood was further collected in accordance with a previous report (16). Serum apelin and insulin concentrations were measured using an apelin-12 enzyme immunoassay (EIA) kit (Phoenix Pharmaceuticals, Belmont, CA) and a mouse high range insulin enzyme-linked immunosorbent assay kit (ALPCO, Salem, NH), and blood glucose was measured using a glucose meter (Contour Blood Glucose Meter). The homeostatic model assessment of insulin resistance (HOMA-IR) and pancreatic β-cell function (HOMA-%B) were calculated in accordance with the following formula: HOMA-IR [fasting insulin in μU/ml × (fasting blood glucose in mg/dl × 0.055)/22.5]; HOMA-%B [(360 × fasting insulin in μU/ml)/(fasting blood glucose − 63)] (16).

GC-MS analysis

Frozen tissues were homogenized, and proteins were extracted using lysis buffer (20 mM tris-HCl, 4.0 mM EDTA, 20 mM NaCl, and 1% SDS). Ten milligrams of samples was used for gas chromatography–mass spectrometry (GC-MS) analysis based on a previous report (41).

RNA extraction, cDNA synthesis, and quantitative real-time PCR

Total RNA was extracted from tissues and cells by TRIzol reagent (Invitrogen, Grand Island, NY) followed by the manufacturer’s guidelines. Reverse transcription was conducted to make complementary DNA (cDNA) using the iScript cDNA Synthesis Kit (Bio-Rad, Hercules, CA). SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad) was used for measuring relative mRNA expression by real-time quantitative PCR (iQ5, Bio-Rad). The RNA expression was normalized to the 18S ribosomal RNA (10, 37). Primer sequences are listed in table S1.

Methylated DNA immunoprecipitation–PCR

DNA (20 μg) was isolated from iBAT tissues using lysis buffer (20 mM tris-HCl, 4.0 mM EDTA, 20 mM NaCl, and 1% SDS) and proteinase K solution[50mMtris-HCl10mMCaCl[50mMtris-HCl10mMCaCl[50mMtris-HCl10mMCaCl[50mMtris-HCl10mMCaCl2, and proteinase K (20 mg/ml)]. The DNA was diluted with tris-EDTA (TE ) buffer and sonicated. Antibodies against 5hmC (#51660), 5mC (#28692), or immunoglobulin G (IgG) (#7054) were added into denatured DNA (2 μg) diluted with 10× immunoprecipitation (IP) buffer (100 mM Na phosphate, 1.4 M NaCl, and 0.5% Triton X-100). The DNA-antibody complexes were pulled down with EcoMag Protein A Magnetic Particles (#MJA-102, Bioclone Inc., San Diego, CA). The captured beads were washed two times with 1× IP buffer and resuspended in proteinase K solution. Immunoprecipitated DNA was used for real-time qPCR using SsoAdvanced Universal SYBR Green Supermix (Bio-Rad). Relative folds of enrichment were normalized to that of IgG (42), and primers are listed in table S1.

RNAseq by WTTS sequencing

These experiments were conducted on the basis of a previous report (43). Briefly, 105 million raw reads were generated from Poly(A)-seq, of which 96% were kept after quality control and length filter of reads. Then, alignment was performed and mapped to the reference genome (Mus_musculus.GRCm38).

Western blot analysis

Proteins were isolated from tissues with lysis buffer[100mMtris-HCl(pH68)20%SDS20%glycerol002%bromophenolblue5%2-mercaptoethanol100mMNaFand1mMNa[100mMtris-HCl(pH68)20%SDS20%glycerol002%bromophenolblue5%2-mercaptoethanol100mMNaFand1mMNa[100mMtris-HCl(pH68)20%SDS20%glycerol002%bromophenolblue5%2-mercaptoethanol100mMNaFand1mMNa[100mMtris-HCl(pH68)20%SDS20%glycerol002%bromophenolblue5%2-mercaptoethanol100mMNaFand1mMNa3VO4]. The concentration of homogenized protein lysates was determined by the Bradford method (Bio-Rad). The following antibodies were used for the detection of target proteins: UCP1 (#14670), phospho-PKA (#5661), total PKA (#4782), phospho-AMPK (#2535), and total AMPK (#2793) were purchased from Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Antibodies against glucose transporter 4 (GLUT4; sc-1607), apelin (sc-293441), and HIF-1α (sc-13515) were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX). PRDM16 (PA5-20872; Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL) and PGC-1α (no. 66369-1-Ig; Proteintech, Rosemont, IL) were also purchased. Antibodies against β-actin and β-tubulin were obtained from the Developmental Studies Hybridoma Bank (Iowa City, IA). IRDye 680 goat anti-mouse secondary antibody (1:10,000), IRDye 800CW donkey anti-rabbit secondary antibody (1:10,000), and IRDye 800CW donkey anti-goat secondary antibody (1:10,000) were purchased from LI-COR Biosciences (Lincoln, NE). The target proteins were detected using the infrared imaging system (Odyssey, LI-COR Biosciences), and intensity of band was quantified using Image Studio Lite (LI-COR Biosciences) (16).

Histological and image analyses

Fresh tissues were fixed in 4% paraformaldehyde for 24 hours at RT and then embedded in paraffin. Sections (5 μm thick) were used for UCP1 (1:200) (#14670, Cell Signaling) immunocytochemistry (ICC) staining or hematoxylin and eosin (H&E) staining in iBAT and ingWAT as previously described (16). In addition, 5-μm-thick sections from placenta at E18.5 were used for apelin (1:50) (#11497-1-AP, Proteintech) ICC staining. Goat anti-mouse IgG2b Alexa Fluor 488 secondary antibody (#A-21141; 1:250; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) and anti-rabbit IgG Alexa Fluor 488 secondary antibody (#4412; 1:250; Cell Signaling Technology) were used. The cross-sectional areas of lipid droplet were measured using ImageJ software (National Institutes of Health, Bethesda, MD). For Oil Red O staining, liver samples from the offspring were fixed in PBS containing 4% paraformaldehyde and embedded in optimal cutting temperature compound (Thermo 6502, Thermo Fisher Scientific). Sections at 10-μm thickness were stained, and images were obtained by EVOS XL Core Imaging System (Mill Creek, WA).

Statistical analyses

Data were visualized by using GraphPad Prism 7 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA) and analyzed using statistical analysis software (SAS Institute Inc., Cary, NC). Results were reported as mean ± SEM. Two-tailed unpaired or paired Student’s t test was applied for comparison. Analysis of variance (ANOVA) was used for comparisons among multiple groups. Statistical differences were indicated as *P < 0.05, **P < 0.01, and ***P < 0.001 (or #P < 0.05, ##P < 0.01, and ###P < 0.001).

This is an open-access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution-NonCommercial license, which permits use, distribution, and reproduction in any medium, so long as the resultant use is pas for commercial advantage and provided the original work is properly cited.

Acknowledgments: We thank P. W. Nathanielsz (Texas Biomedical Research Institute, San Antonio, TX, USA) for proofreading the manuscript. Funding: This work was supported by the NIH (NIH R01-HD067449). Author contributions: Conceptualization: J.S.S. and M.D.; methodology: J.S.S., L.Z., Y.C., K.C., S.A.C., and J.M.d.A.; investigation: J.S.S., S.A.C., and M.D.; analysis: J.S.S., Y.C., S.A.C., H.W., M.-J.Z., Z.J., and M.D.; interpretation: J.S.S., H.W., M.-J.Z., Z.J., and M.D.; writing: J.S.S.; review and editing: M.D.; funding acquisition: M.D. Competing interests: The authors declare that they have no competing interests. Data and materials availability: All data needed to evaluate the conclusions in the paper are present in the paper and/or the Supplementary Materials. Additional data related to this paper may be requested from the authors.

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